孔雀石绿 (MG) 和结晶紫 (CV) 属于人工合成的染料，因其价格低廉、使用方便，常用于鱼类水霉病等寄生虫病的防治，或作为消毒剂用于鲜活鱼类运输过程中以延长鱼类的存活时间。实验研究表明，孔雀石绿或结晶紫进入人或动物机体后，可还原代谢为脂溶性隐色孔雀石绿 (LMG) 或隐色结晶紫 (LCV)。LMG 和 LCV 具有高毒性、高残留和致癌、致突变等副作用，严重威胁消费者的身体健康。我国农业部在 2002 年 5 月将孔雀石绿列入《食品动物禁用的兽药及其化合物清单》中，禁止将其用于所有食品动物。
本文建立了一种采用 Captiva EMR 前处理方法结合 LC/QQQ 分析草鱼中孔雀石绿和结晶紫的方法。该方法使用 5% 甲酸乙腈提取鱼肉样品，使用 Agilent Captiva EMR 小柱净化，并通过 Agilent Poroshell 120 EC-C18 色谱柱快速分离。
图 1. 样品前处理流程图
内标和 TMPD 溶液的配制：取适量同位素标记的孔雀石绿 (MG-D5)和同位素标记的隐色孔雀石绿 (LMG-D6) 配成 100 μg/L 的内标溶液。用甲醇溶解 50 mg N,N,N,N-四甲基-1,4-对苯二胺二盐酸 盐，并定容至 50 mL，配置成TMPD 溶液。
表 1. 色谱条件
表 2. 质谱条件
表 3. 多反应监测模式监测的离子对
提取溶液的选择
由于孔雀石绿 (MG) 和结晶紫 (CV) 的回收率偏低，我们采用不同浓度的酸化乙腈作为提取溶剂，通过回收率的计算来考察提取效率。随着甲酸浓度的提高，回收率也有所增加。酸度的提高增加了孔雀石绿 (MG) 的稳定性，使其不易在操作过程中降解。除结晶紫 (CV) 外，其他组分的回收率均有一定程度的提高。因此暂时选择 5% 甲酸乙腈作为提取溶剂，在后续步骤中继续优化条件。
图 2. 不同浓度酸化乙腈洗脱回收率比较
洗脱体积的优化
为提高显色结晶紫 (CV) 的回收率，本方法在常规 EMR 前处理方法的基础上增加了一步洗脱。随着洗脱体积的增加，回收率有所提高。但是使用过多的洗脱溶剂时，可能增加稀释体积和杂质。通过优化洗脱曲线，发现采用 2 mL 80% 乙腈水溶液得到的洗脱回收率最高。
图 3. 洗脱溶剂采用不同洗脱体积回收率比较
线性和回收率
如表 4、表 5 和图 4 所示，本文所述方法适合对草鱼中的孔雀石绿 (MG) 和结晶紫 (CV) 进行检测。该方法的线性相关范围为0.5–10 µg/L（内标浓度为 1.0 µg/L）；在 0.5 µg/kg、1.0 µg/kg、2.0 µg/kg 加标浓度下的回收率为81.8%–97.5%，且 RSD ≤3.53%。MG 和 LMG 的回收率用内标法进行校正，CV 和 LCV 的回收率用基质外标法进行校正。
表 4. 孔雀石绿和结晶紫的线性
表 5. 鱼肉中孔雀石绿和结晶紫的回收率与重现性 (n = 6)
图 4. 总离子流图
本文将 Captiva EMR 前处理方法与 LC/QQQ 结合使用，建立了一种同时测定孔雀石绿 (MG)、结晶紫 (CV) 及其代谢物隐色孔雀石绿 (LMG) 和隐色结晶紫 (LCV) 的分析方法。该方法具有快速、操作简单等优点。其中采用过滤式小柱可有效去除水产品中的脂质，同时简化样品前处理步骤，且回收率在 81.8% 以上。